L'epitelio pigmentato retinico è un monostrato di cellule cuboidali fortemente polarizzate, interposto tra i segmenti esterni dei fotorecettori e la coriocapillare e ancorato sul versante basale alla membrana di Bruch. Da questa posizione governa un insieme di processi indispensabili alla visione, dalla fagocitosi quotidiana dei dischi dei segmenti esterni al riciclo dei retinoidi che alimenta il ciclo visivo, dal trasporto vettoriale di ioni, acqua e metaboliti tra retina neurale e circolo coroideale all'assorbimento della luce diffusa mediato dalla melanina, fino alla secrezione polarizzata di fattori trofici, con il PEDF diretto apicalmente verso i fotorecettori e il VEGF rilasciato sul versante basolaterale a sostenere l'integrità della coriocapillare. La compromissione di questo strato è l'evento che innesca o accompagna la degenerazione maculare legata all'età, sia nella forma atrofica con atrofia geografica sia nella forma essudativa con neovascolarizzazione coroideale, e caratterizza numerose distrofie retiniche ereditarie in cui il difetto genetico si esprime primariamente proprio nell'RPE.
Perché non basta iniettare cellule in sospensione
Le prime strategie rigenerative hanno puntato sull'iniezione sottoretinica di sospensioni cellulari, ma questo approccio incontra limiti biologici difficilmente aggirabili. Le cellule dell'RPE sono epiteliali ancoraggio-dipendenti e, private di un substrato su cui distendersi, vanno incontro ad anoikis, perdono la polarità apico-basale e non ricostituiscono le giunzioni serrate che definiscono la barriera emato-retinica esterna. A ciò si aggiunge il fatto che, nell'occhio degenerato, la membrana di Bruch è essa stessa alterata, ispessita e ricca di depositi, e offre un letto di attecchimento inadeguato. Ne deriva un razionale forte per la consegna di un monostrato già formato, maturo e polarizzato, sostenuto da una membrana di Bruch protesica che funga insieme da carrier chirurgico e da matrice provvisoria. È in questo spazio che la fibroina della seta si è imposta come uno dei biomateriali più studiati.
Le proprietà che rendono la fibroina una membrana di Bruch protesica
La fibroina risponde a un profilo di requisiti che pochi materiali soddisfano contemporaneamente. È biocompatibile e scarsamente immunogenica una volta rimossa la sericina, presenta una degradazione enzimatica lenta e modulabile, tollera una lavorazione interamente in fase acquosa e, non ultimo, può essere resa otticamente trasparente, caratteristica non irrilevante per un impianto destinato a interporsi lungo l'asse visivo. La sua chimica consente inoltre di regolare in modo indipendente rigidità, porosità e cinetica di riassorbimento, permettendo di disaccoppiare parametri che in altri sistemi restano vincolati tra loro. Il confronto con le alternative chiarisce il vantaggio. I poliesteri sintetici come il PLGA rilasciano prodotti di degradazione acidi che possono acidificare il microambiente sottoretinico, la membrana amniotica soffre di una marcata variabilità donatore-dipendente, i film di collagene tendono a una degradazione poco controllabile. La fibroina occupa una posizione intermedia favorevole, coniugando l'affidabilità di un polimero naturale con una prevedibilità di comportamento vicina a quella dei materiali di sintesi.
Struttura e lavorazione della fibroina rigenerata
Il comportamento della membrana finale si decide a monte, nella chimica della proteina e nel suo processing. La fibroina di Bombyx mori è organizzata in una catena pesante e una leggera unite da ponte disolfuro, con domini idrofobici che tendono a impaccarsi in foglietti beta. Il grado di cristallinità in configurazione silk II, contrapposta alla forma amorfa silk I, è la leva principale che governa sia la resistenza meccanica sia la velocità di degradazione. La produzione di fibroina rigenerata parte dalla sgommatura, che elimina la sericina responsabile della maggior parte delle risposte infiammatorie, prosegue con la dissoluzione in bromuro di litio e la dialisi, e si conclude con la formatura. Nei substrati a film sottile, l'aggiunta di poli(ossido di etilene) come porogeno introduce una porosità controllata, mentre il trattamento con metanolo o l'annealing in vapore acqueo induce la transizione a foglietti beta e stabilizza la membrana modulandone la stabilità. La versatilità dei formati completa il quadro, dai film colati per casting alle membrane nanofibrose ottenute per electrospinning, fino agli idrogeli. Un'opzione ulteriore è offerta dalla fibroina selvatica di Antheraea pernyi, che a differenza di quella di Bombyx mori contiene nativamente motivi RGD in grado di promuovere l'adesione cellulare integrino-mediata senza bisogno di funzionalizzazioni esogene.
I vincoli biomimetici imposti dalla membrana di Bruch nativa
Ogni scelta progettuale è tenuta a confrontarsi con l'architettura della membrana che intende sostituire. La membrana di Bruch nativa è una lamina pentastratificata di appena due-quattro micrometri, che si ispessisce con l'età e che deve garantire il passaggio bidirezionale di nutrienti, cataboliti e fluidi tra RPE e coroide. Uno scaffold destinato allo spazio sottoretinico deve quindi essere ultrasottile, perché eccedere lo spessore tollerabile significa comprometterne l'alloggiamento e disturbare i rapporti con i fotorecettori sovrastanti; alcuni carrier lenticolari, con spessori nell'ordine delle decine di micrometri, hanno mostrato proprio questo limite. Le membrane di fibroina di Bombyx mori sviluppate come sostituto della membrana di Bruch sono state ottenute con spessori attorno ai tre micrometri, coefficienti di permeabilità compresi tra circa tre e nove per dieci alla meno cinque centimetri al secondo e pori dell'ordine di alcuni micrometri, valori compatibili con lo scambio metabolico richiesto in situ. Restano centrali anche la compliance meccanica, che deve avvicinare quella del tessuto ospite, e la cinetica di degradazione, idealmente sincronizzata con la deposizione di matrice extracellulare endogena da parte delle cellule trapiantate, in modo che il riassorbimento del supporto proceda di pari passo con la costruzione della sua sostituzione biologica.
Adesione, polarizzazione e maturazione dell'RPE sul substrato
La sola compatibilità geometrica non è sufficiente, perché l'RPE esprime il proprio fenotipo solo se il substrato ne guida adesione e polarizzazione. Sulle membrane di fibroina l'attecchimento ottimale della linea ARPE-19 è stato ottenuto pre-rivestendo la superficie con vitronectina a concentrazioni dell'ordine di un microgrammo per millilitro, e strategie analoghe impiegano laminina, collagene di tipo IV o peptidi RGD per ingaggiare le integrine cellulari. Quando il dialogo tra cellula e matrice è corretto, le colture sviluppano la morfologia a ciottolato tipica dell'epitelio maturo, con distribuzione corticale della F-actina, giunzioni serrate marcate dalla ZO-1, microvilli apicali e ripiegamenti basali, accompagnati dalla comparsa della pigmentazione. La maturazione si documenta sul piano molecolare attraverso l'espressione di marcatori quali RPE65 e CRALBP del ciclo visivo, la bestrofina codificata da BEST1, il fattore trascrizionale MITF e le proteine dei melanosomi, e sul piano funzionale attraverso la resistenza elettrica transepiteliale, indice della tenuta di barriera, la secrezione polarizzata di PEDF e VEGF e la capacità di fagocitare segmenti esterni dei fotorecettori. È significativo che colture di RPE mantenute per settimane su substrati nanofibrosi di fibroina abbiano conservato proprio la secrezione polarizzata del PEDF e l'attività fagocitaria, due funzioni tra le più difficili da preservare in vitro e tra le più predittive di un comportamento fisiologico dopo l'impianto.
Dal modello cellulare alle cellule staminali pluripotenti
Gran parte della caratterizzazione iniziale si è appoggiata alla linea ARPE-19, utile come modello ma non idonea all'impiego clinico per il suo fenotipo incompleto. Il passaggio decisivo è stato dimostrare che le membrane di fibroina sostengono la maturazione di RPE derivato da cellule staminali, prima embrionali e poi pluripotenti indotte. La generazione di un monostrato funzionale di RPE da hiPSC su una membrana di Bruch protesica in fibroina di Bombyx mori ha rappresentato in questo senso un risultato di riferimento, perché ha collegato un biomateriale ben caratterizzato a una sorgente cellulare scalabile e clinicamente percorribile. Sul piano traslazionale la scelta della fonte non è neutra. Le iPSC autologhe eliminano il problema dell'istocompatibilità e riducono il ricorso all'immunosoppressione, ma impongono tempi e costi di produzione individuali difficilmente compatibili con una diffusione ampia, mentre le linee allogeniche selezionate per compatibilità HLA e organizzate in banche cellulari promettono un prodotto pronto all'uso, al prezzo di una gestione più attenta della risposta immunitaria, tanto più che l'immunoprivilegio della retina presuppone un RPE e una membrana di Bruch integri, condizione proprio venuta meno nel paziente da trattare.
Evidenze in vivo e prospettiva clinica
Il profilo in vivo della fibroina in ambito oculare è incoraggiante. Membrane nanofibrose composite di fibroina selvatica, policaprolattone e gelatina, prodotte per electrospinning con spessori di tre-cinque micrometri e fibre di diametro nanometrico, hanno sostenuto colture di RPE umano fino a dodici settimane e, impiantate per via sottosclerale in modelli animali, si sono dimostrate biocompatibili senza segni di reazione infiammatoria. Va però collocata con onestà la posizione della fibroina nel panorama clinico. Gli impianti di RPE su scaffold arrivati fino alla sperimentazione sull'uomo si sono finora basati soprattutto su membrane di poliestere e parylene con RPE derivato da cellule embrionali, su patch in PLGA con RPE da iPSC, su membrana amniotica e su idrogeli di fibrina, mentre la fibroina resta a oggi un candidato in fase preclinica avanzata. La sua combinazione di trasparenza, degradazione modulabile, lavorazione acquosa e comportamento riproducibile ne fa nondimeno uno dei materiali naturali con le maggiori probabilità di transizione clinica, in un campo in cui la scelta del carrier incide sull'esito quanto la qualità delle cellule trapiantate.
