La terapia canalare convenzionale risolve il problema dell'infezione endodontica sacrificando l'organo che l'ha subita. Una volta rimossa la polpa e sostituita con guttaperca e cemento, il dente perde la propria capacità di rispondere agli stimoli, di produrre dentina reattiva, di segnalare con il dolore un'aggressione cariosa o traumatica e di opporre una difesa immunitaria locale alla contaminazione batterica. Nei denti permanenti immaturi il prezzo è ancora più alto, perché l'interruzione dello sviluppo radicolare lascia pareti sottili e un apice beante, con un rischio di frattura che nessun materiale da otturazione è in grado di compensare. L'endodonzia rigenerativa nasce esattamente da questa insoddisfazione, con l'obiettivo di restituire al canale un tessuto vitale, vascolarizzato, innervato e capace di dentinogenesi.
I protocolli clinici oggi più diffusi si basano sulla rivascolarizzazione per sanguinamento evocato. Dopo la disinfezione del sistema canalare si provoca un sanguinamento dalla regione periapicale, il coagulo riempie il canale e funge da impalcatura provvisoria per le cellule staminali della papilla apicale che migrano al suo interno. I risultati radiografici sono spesso incoraggianti, con ispessimento delle pareti e allungamento della radice, ma l'analisi istologica dei denti estratti racconta una storia diversa. Il tessuto che si forma assomiglia più a cemento, osso e tessuto connettivo fibroso che a una vera polpa con uno strato odontoblastico ordinato. Il coagulo è un'impalcatura imprevedibile per volume, composizione e durata, non trattiene i fattori di crescita in modo controllato e non offre alle cellule un segnale meccanico coerente con il fenotipo pulpare. È su questo vuoto di controllo che la ricerca sui biomateriali si è concentrata, e le proteine della seta vi occupano una posizione particolare.
Un microambiente che impone vincoli precisi
Prima di valutare qualunque scaffold conviene ricordare quanto sia ostile l'ambiente in cui deve operare. Il canale radicolare è uno spazio a bassa compliance, chiuso lateralmente da dentina mineralizzata e raggiungibile dalla vascolarizzazione solo attraverso un forame apicale che nei denti maturi misura frazioni di millimetro. La perfusione ematica arriva quindi da una sola direzione, il gradiente di ossigeno è ripido e il nucleo di qualunque costrutto voluminoso tende all'ipossia. A questo si aggiungono il biofilm residuo che nessun protocollo di irrigazione elimina del tutto, i residui di ipoclorito di sodio che possono ossidare le superfici e ridurre l'adesione cellulare, e il condizionamento con EDTA che, oltre a rimuovere lo smear layer, libera dalla matrice dentinale TGF-β1, BMP e altri segnali sequestrati durante la dentinogenesi primaria.
Uno scaffold per la polpa deve dunque essere iniettabile o almeno adattabile a una geometria irregolare e sottile, deve avere una rigidità compatibile con quella di un tessuto connettivo lasso, che si colloca nell'ordine di pochi kilopascal, deve permettere l'invasione vascolare dall'apice verso la camera pulpare e deve degradarsi con una cinetica tale da lasciare spazio alla matrice neoformata senza collassare prima che questa sia in grado di sostenersi. Deve inoltre tollerare l'interfaccia con la dentina condizionata e, idealmente, sfruttare i fattori che questa rilascia invece di mascherarli.
La fibroina come matrice regolabile
La fibroina rigenerata si presta a questo insieme di vincoli per ragioni che chi lavora con le proteine della seta conosce bene, ma che nel contesto endodontico acquistano un peso specifico. La possibilità di modulare la rigidità agendo sulla concentrazione della soluzione, sul contenuto di foglietti β e sul metodo di induzione della transizione conformazionale consente di ottenere matrici che vanno dal gel morbido alla spugna porosa, mantenendo la stessa chimica di base. La degradazione proteolitica, lenta rispetto a collagene e fibrina e modulabile attraverso il grado di cristallinità e il peso molecolare delle catene ottenuto in fase di degommaggio, permette di calibrare la persistenza dello scaffold sui tempi della dentinogenesi, che si misurano in settimane e mesi piuttosto che in giorni.
I primi lavori sistematici su cellule della polpa coltivate su scaffold di seta vengono dal gruppo di Pamela Yelick in collaborazione con il laboratorio di David Kaplan alla Tufts University. Già nel 2008 Xu e colleghi avevano utilizzato spugne porose di fibroina seminate con cellule di gemma dentale suina, osservando dopo impianto in vivo la formazione di tessuti mineralizzati di tipo dentinale e smalto-simile, con un'organizzazione influenzata dalla dimensione dei pori. Nel 2011 Zhang e colleghi hanno confrontato il comportamento di progenitori della polpa umana su scaffold ottenuti da soluzioni acquose e da soluzioni in esafluoroisopropanolo, due vie di processamento che producono architetture porose, cristallinità e velocità di degradazione differenti. Il confronto ha mostrato che la via di fabbricazione non è un dettaglio tecnico neutro, perché incide su proliferazione, distribuzione cellulare e deposizione di matrice mineralizzata. Da questi studi si ricava un'indicazione che vale ancora oggi, ossia che nella polpa la scelta del processo di fabbricazione della fibroina va fatta in funzione del fenotipo che si vuole ottenere e non per abitudine di laboratorio.
Idrogel iniettabili e gelificazione in situ
Le spugne porose preformate sono utili per lo studio in vitro e negli impianti ectopici, ma difficilmente si adattano a un canale radicolare reale. Per l'applicazione endodontica la forma più coerente è l'idrogel iniettabile che gelifica dopo il posizionamento. La fibroina offre diverse strade per ottenerlo. La sonicazione accelera l'assemblaggio dei foglietti β e consente di regolare il tempo di gelificazione in una finestra di minuti, sufficiente per miscelare cellule o fattori e iniettare la soluzione prima che solidifichi. La reticolazione enzimatica mediata da perossidasi di rafano e perossido di idrogeno, che sfrutta i residui tirosinici naturalmente abbondanti nella catena pesante, produce invece gel inizialmente amorfi, elastici e molto morbidi, che nel tempo evolvono spontaneamente verso una maggiore cristallinità e quindi verso un irrigidimento progressivo. Questo comportamento, che in altri contesti può rappresentare un limite, nella polpa si presta a una lettura interessante, perché una matrice che parte morbida favorisce la migrazione e l'angiogenesi e si consolida quando la fase proliferativa lascia spazio alla differenziazione.
Le formulazioni con comportamento pseudoplastico, ottenute per esempio miscelando fibroina parzialmente assemblata o combinandola con altri polimeri, facilitano l'estrusione attraverso aghi endodontici di calibro ridotto e il recupero della viscosità una volta deposte nel canale. La fibroina di per sé non contiene sequenze di adesione integrina-specifiche in quantità paragonabile al collagene, e per questo molti gruppi ricorrono alla funzionalizzazione con peptidi RGD o alla miscelazione con gelatina, collagene o acido ialuronico per migliorare l'adesione e la diffusione delle cellule staminali della polpa e della papilla apicale all'interno del gel.
Veicolazione dei segnali e dentinogenesi
Il vero punto di forza della fibroina in endodonzia rigenerativa è la sua capacità di stabilizzare e rilasciare molecole bioattive in condizioni fisiologiche. I domini idrofobici ripetuti e la struttura a foglietti β creano microambienti in cui proteine sensibili come VEGF, bFGF, PDGF e BMP mantengono la propria conformazione più a lungo che in soluzione o in matrici idrofiliche convenzionali, e la processazione in fase acquosa a temperatura ambiente evita i solventi organici e le temperature che denaturerebbero i fattori durante il caricamento. Il rilascio può essere modulato inglobando i fattori direttamente nel gel, adsorbendoli su micro e nanoparticelle di fibroina a diversa cristallinità disperse nella matrice, oppure combinando le due strategie per ottenere profili differenziati.
Questa modularità è rilevante perché la rigenerazione pulpare richiede una sequenza temporale di segnali. Nelle prime fasi serve un forte stimolo angiogenico e chemiotattico che richiami le cellule dall'apice e garantisca la perfusione del costrutto, mentre nelle fasi successive prevalgono i segnali odontogenici che portano all'espressione di DSPP, DMP-1 e degli altri marcatori della linea odontoblastica. Sistemi a doppio rilascio in fibroina, con VEGF disponibile rapidamente e un fattore osteo-odontogenico trattenuto più a lungo nelle particelle a elevata cristallinità, riproducono questa sequenza meglio di un coagulo o di una matrice che rilascia tutto il proprio carico nelle prime ore. La fibroina si presta anche a veicolare le proteine estratte dalla matrice dentinale stessa, un approccio che sfrutta segnali già naturalmente presenti nel dente e riduce la dipendenza da fattori ricombinanti costosi.
Un aspetto meno discusso riguarda il ruolo del condizionamento dentinale. Il TGF-β1 liberato dall'EDTA diffonde nel canale e può essere intercettato dallo scaffold. Un idrogel di fibroina posto a contatto con la dentina condizionata tende a trattenere parte di questi fattori nello strato più vicino alla parete, e proprio in quella regione ci si aspetta la polarizzazione di cellule simil-odontoblastiche. Il gradiente che si crea tra una periferia ricca di segnali odontogenici e un centro dominato dal VEGF eventualmente caricato nel gel ricalca, almeno in linea di principio, l'organizzazione della polpa nativa con il suo strato odontoblastico periferico e il nucleo vascolare centrale.
Il contributo della sericina
Per lungo tempo la sericina è stata considerata un sottoprodotto da eliminare con cura, sospettata di essere responsabile delle reazioni immunitarie attribuite alla seta. Studi più recenti hanno ridimensionato questa lettura, mostrando che le risposte infiammatorie osservate derivavano soprattutto dall'associazione tra sericina e fibroina nella fibra nativa e non dalla sericina purificata in quanto tale. Nel contesto pulpare le proprietà della sericina assumono un interesse specifico, perché la polpa da rigenerare nasce in un ambiente che è stato infiammato, spesso cronicamente, e che conserva uno stress ossidativo elevato anche dopo la disinfezione.
La sericina possiede un'attività antiossidante legata all'elevato contenuto di serina e di residui con gruppi idrossilici, esercita un effetto di modulazione sulla produzione di citochine pro-infiammatorie da parte dei macrofagi e sostiene adesione e proliferazione di diversi tipi di cellule mesenchimali. In vitro, l'aggiunta di sericina a scaffold di fibroina o la preparazione di idrogel compositi fibroina-sericina ha mostrato di migliorare la vitalità delle cellule staminali di origine dentale e di attenuare gli effetti citotossici di agenti ossidanti. La sericina è inoltre molto più idrofilica della fibroina e, in una matrice composita, accelera l'idratazione e la diffusione dei nutrienti nelle prime ore dopo l'impianto, proprio quando il costrutto dipende interamente dalla diffusione dall'apice.
La sua degradazione rapida rispetto alla fibroina è un limite se la si usa da sola come scaffold strutturale, ma diventa un vantaggio se la si considera come componente transitoria che esercita un'azione protettiva nella fase precoce e lascia poi il posto alla matrice di fibroina e al tessuto neoformato. La variabilità legata al metodo di estrazione, che può produrre frazioni di peso molecolare molto diverse, resta però un parametro da controllare con attenzione, perché influisce sia sull'attività biologica sia sulla stabilità dei gel.
Controllo della carica batterica
La disinfezione è il presupposto di qualunque procedura rigenerativa, e rappresenta anche uno dei suoi paradossi. La pasta triantibiotica e gli idrossidi di calcio usati come medicazioni intracanalari sono efficaci contro il biofilm ma, alle concentrazioni tradizionali, risultano tossici per le cellule staminali della papilla apicale che dovrebbero ripopolare il canale. Le matrici di fibroina offrono una via per ridurre questa contraddizione, perché consentono di rilasciare antibiotici o agenti antimicrobici in modo prolungato a concentrazioni locali più basse, mantenendo un effetto batteriostatico sulla superficie dentinale senza i picchi citotossici delle medicazioni convenzionali.
Sono stati studiati film e nanofibre elettrofilate di fibroina caricate con antibiotici, così come compositi con nanoparticelle d'argento o con composti di origine naturale ad attività antimicrobica. La fibroina protegge anche in questo caso la molecola veicolata e ne regola la diffusione in funzione della propria cristallinità. Alcuni approcci combinano nella stessa matrice un compartimento antimicrobico destinato alla fase iniziale e un compartimento rigenerativo che si attiva successivamente, sfruttando la stratificazione del gel o particelle a diversa stabilità.
Compositi con silicati di calcio e incappucciamento pulpare
Accanto alla rigenerazione dell'intero canale esiste un ambito più conservativo, quello dell'incappucciamento pulpare diretto e della pulpotomia, in cui l'obiettivo è preservare la polpa residua e indurre la formazione di un ponte di dentina riparativa. Il riferimento clinico sono i cementi a base di silicati di calcio, MTA e materiali derivati, che garantiscono un ottimo sigillo e liberano idrossido di calcio favorendo la mineralizzazione, ma presentano tempi di presa lunghi, difficoltà di manipolazione e un pH iniziale molto elevato che causa uno strato superficiale di necrosi.
La combinazione di fibroina con silicati di calcio, idrossiapatite o vetri bioattivi mira a ottenere materiali che conservino la bioattività della componente minerale migliorandone la manipolazione e riducendo l'aggressività iniziale sull'interfaccia pulpare. La fibroina agisce come fase organica che modula il rilascio ionico, attenua il picco alcalino e fornisce un supporto per l'adesione delle cellule della polpa, mentre la componente inorganica guida la nucleazione minerale. Negli studi su modelli animali sono stati osservati ponti dentinali con continuità e spessore paragonabili o superiori a quelli ottenuti con i materiali di riferimento, insieme a un'infiammazione pulpare sottostante più contenuta. La fibroina, grazie alla sua capacità di legare ioni calcio attraverso i residui acidi della catena e di orientare la deposizione di idrossiapatite, può partecipare attivamente al processo di mineralizzazione invece di limitarsi a fare da veicolo.
L'interfaccia con la dentina
Il punto che più di ogni altro separa un buon risultato sperimentale da un tessuto pulpare funzionale è l'interfaccia tra matrice e parete dentinale. Una polpa vera non è semplicemente un connettivo vascolarizzato che riempie il canale, ma un tessuto in cui gli odontoblasti si dispongono lungo la dentina, estendono i propri processi nei tubuli e depositano nuova predentina con una polarità definita. Quando lo scaffold si separa dalla parete, anche per pochi micrometri, questa organizzazione non si forma e il risultato tende verso il tessuto mineralizzato disordinato osservato nelle rivascolarizzazioni con coagulo.
La fibroina ha una buona affinità per le superfici di dentina condizionata, grazie alle interazioni con il collagene esposto dall'EDTA e con i residui minerali, e gli idrogel a gelificazione in situ riempiono le irregolarità della parete meglio di uno scaffold preformato. La contrazione che accompagna l'aumento di cristallinità nel tempo è però un fattore che va misurato e compensato, perché può aprire proprio quell'interstizio che si voleva evitare. Le formulazioni che mantengono una fase amorfa elastica più a lungo, come quelle a reticolazione enzimatica, o che includono una componente composita capace di aderire chimicamente alla dentina, sembrano oggi le più adatte a mantenere la continuità dell'interfaccia durante le settimane in cui le cellule periferiche si polarizzano e iniziano a depositare matrice. È su questo dettaglio, più che sulla composizione del nucleo del costrutto, che si gioca la differenza tra un canale semplicemente riempito di tessuto vitale e una polpa che torna a comportarsi come tale.
