Prima ancora di discutere le soluzioni, vale la pena soffermarsi sul nodo centrale che rende così difficile la terapia a base di RNA. I principali meccanismi di degradazione dell'mRNA includono la degradazione fisica e quella chimica, con l'idrolisi come forma principale di distruzione: sia le nucleasi self-cleaving sia le nucleasi proteiche possono compromettere la stabilità dell'RNA attraverso questo meccanismo. A tutto ciò si aggiunge la problematica della stabilità termica in quanto i vaccini e i costrutti a mRNA richiedono nella loro formulazione convenzionale condizioni di stoccaggio criogenico che rendono la loro distribuzione globale capillare un'impresa logistica di enorme complessità.
È in questo contesto che la fibroina ha cominciato ad attirare l'attenzione come candidata non convenzionale ma straordinariamente promettente per la formulazione di sistemi di delivery nucleici. Le sue proprietà fisicochimiche e meccaniche, la controllabile biodegradazione e l'approvazione da parte della FDA per specifiche applicazioni mediche la rendono un candidato ideale per l'incapsulamento e il rilascio di un'ampia gamma di farmaci, dalle piccole molecole fino ai biologici e agli acidi nucleici.
Il profilo strutturale come punto di partenza per il design del carrier
La comprensione delle proprietà fisicochimiche della fibroina è imprescindibile per capire perché essa si presti così bene a fungere da carrier per molecole nucleiche. Rispetto ad altri polimeri naturali, la SF mostra una cinetica di degradazione più lenta e maggiormente controllabile, e un elevato grado di adattabilità tramite le condizioni di processamento. Un vantaggio chiave è la possibilità di ingegnerizzare idrogel a base di SF con caratteristiche specifiche — iniettabili, auto-riparanti o stimolo-responsive — controllando il meccanismo di gelificazione.
Questa adattabilità si esprime concretamente nelle molteplici architetture formali che la fibroina può assumere. A differenza di molti altri polimeri naturali, la SF può essere processata in una vasta gamma di formati — inclusi nanoparticelle, idrogel, nanofibre e scaffold 3D — senza compromettere i suoi benefici fondamentali. Una tale versatilità morfologica non è solo un fatto estetico, ma condiziona profondamente la cinetica di rilascio del cargo nucleico, la capacità di protezione dalle nucleasi e l'efficienza di internalizzazione cellulare. Va sottolineato però che la fibroina nativa presenta una carica di superficie negativa a pH fisiologico — caratteristica che la rende biocompatibile ma al tempo stesso inidonea a complessare direttamente gli acidi nucleici, anch'essi carichi negativamente. Questa limitazione ha aperto un filone di ricerca dedicato alla modificazione chimica della proteina.
La strategia più consolidata per abilitare la fibroina alla complessazione diretta di acidi nucleici è la cationizzazione della proteina mediante l'incorporazione di polimeri policationici. In uno studio rappresentativo, la polietilenimmina a basso peso molecolare (PEI, 1.8 kDa) è stata innestata sulle catene laterali della fibroina di Bombyx mori tramite legami amminici, portando il potenziale zeta da −11.8 mV a +12.4 mV e aumentando l'isoelectric point da 3.68 a 8.82. La CBSF cationizzata così ottenuta riesce a complessare il DNA plasmidico formando complessi sferici CBSF/pDNA, mostrando in vitro un'efficienza di transfettazione superiore a quella dei complessi PEI/pDNA a 25 kDa, con una citotossicità significativamente ridotta sulle cellule normali.
Il vantaggio di questa architettura ibrida va oltre la semplice riduzione di tossicità. I complessi così ottenuti resistono alla digestione da parte di enzimi nucleasici e alla degradazione sierica, un attributo fondamentale per qualsiasi sistema di delivery destinato all'uso in vivo. La fibroina, in pratica, funge da scudo biologico attorno al cargo genico, prolungandone la stabilità plasmatica senza i picchi di tossicità tipici dei polimeri cationici ad alto peso molecolare.
Una variante promettente sfrutta la spermina, un'ammina policationica endogena naturale, come agente di cationizzazione. Nella fibroina di Antheraea pernyi modificata con spermina, i complessi CASF/pDNA mostrano morfologia sferica, dimensioni medie di 215–281 nm, bassa citotossicità e un'efficienza di transfettazione superiore rispetto ai complessi PEI/pDNA.
Il vantaggio dell'ASF rispetto alla fibroina di Bombyx mori risiede anche nella presenza di abbondanti sequenze RGD nella composizione aminoacidica, che conferiscono proprietà di targeting passivo verso cellule che sovraesprimono le integrine — uno scenario particolarmente interessante per il trasferimento genico in ambito oncologico.
Il siRNA come cargo e le dinamiche di complessazione
Nell'ambito della terapia con RNA terapeutico, il siRNA pone requisiti di formulazione particolarmente severi: molecola piccola, carica altamente negativa, emivita plasmatica brevissima senza protezione, e necessità di raggiungere il citoplasma cellulare dove esercita il suo effetto di RNA interference. In nanoparticelle di oligochitosano-fibroina come sistema di delivery per siRNA, la capacità di caricamento del siRNA aumentava proporzionalmente all'incremento della quantità di fibroina, e questi sistemi hanno dimostrato una stabilità molto superiore in presenza di siero e di eparina rispetto ai polyplessi privi di fibroina, oltre a una minore citotossicità e un migliore effetto di gene silencing.
La co-delivery di siRNA e farmaci citotossici rappresenta un'ulteriore applicazione in cui i nanocarrier di fibroina cationizzata mostrano potenziale significativo. Nanoparticelle di SF modificate con PEI per il co-delivery di metformina e siRNA anti-survivina hanno dimostrato di poter proteggere il siRNA dalla degradazione in ambiente endosomiale acido, permettendo la consegna del carico genico e farmacologico con elevata specificità alle cellule tumorali. Il meccanismo di endosomal escape si basa sull'effetto proton sponge tipico della PEI, che in ambiente acido si protona e destabilizza la membrana endosomiale, liberando il cargo nel citoplasma prima della degradazione lisosomiale.
Thermostability e vaccini a mRNA
Uno dei contributi più concreti che la fibroina può offrire alla vaccinologia a mRNA riguarda la stabilizzazione termica del cargo nucleico, rendendo potenzialmente superflua o riducibile la dipendenza dalla catena del freddo. La stabilizzazione esercitata dalla seta a temperature elevate — quelle che causano il deterioramento del vaccino nelle formulazioni convenzionali quando la catena del freddo si interrompe, tra 37°C e 45°C — suggerisce che i film di seta sarebbero in grado di fornire una stabilità sufficiente su un ampio range di temperature di stoccaggio.
Il meccanismo molecolare alla base di questa stabilizzazione è attribuibile alla capacità della matrice proteica di ridurre la mobilità molecolare del cargo incapsulato, rallentando i processi di idrolisi, ossidazione e denaturazione conformazionale. I film di fibroina liofilizzata combinano i vantaggi dello stoccaggio in seta e della liofilizzazione, riducendo ulteriormente la mobilità proteica e migliorando la stabilizzazione rispetto ai film essiccati all'aria.
Applicando questo principio alla vaccinazione transdermica, la fibroina si è rivelata un materiale di elezione per la fabbricazione di microneedles che incorporino vaccini biologici. La fibroina di Bombyx mori possiede proprietà ideali per l'impiego in sistemi a microneedles: processazione completamente acquosa, resistenza meccanica in formati essiccati, biocompatibilità e capacità di termostabilizzare biomacromolecole. Questo biomateriale combina i vantaggi di processazione e biocompatibilità propri dei sistemi a microneedles dissolvibili con la stabilità del prodotto e la resistenza meccanica dei sistemi a microneedles rivestiti e insolubili.
Idrogel di fibroina come depot immunologico
Una delle applicazioni più eleganti nel contesto dei vaccini a mRNA è l'uso di idrogel iniettabili di fibroina come sistemi a rilascio prolungato, che permettano un'esposizione antigenica continua nel tempo, amplificando la risposta immunitaria rispetto alla singola inoculazione in bolo. In un sistema di vaccino basato su antigene RBD-Fc, l'idrogel di SF ha dimostrato ex vivo una ritenzione localizzata, con un rilascio controllato e prolungato rispettivamente del 75% e del 25% dell'antigene nell'arco di 60 giorni, favorendo un'interazione continua tra il sistema immunitario e il peptide virale.
Questo profilo di rilascio è particolarmente prezioso in immunologia: l'esposizione prolungata e graduale all'antigene tende a favorire la maturazione dell'affinità anticorpale, il differenziamento in cellule B della memoria e una risposta T helper più robusta. In un modello di vaccinazione gastrica subsierosa contro Helicobacter felis, l'idrogel di fibroina combinato con il carrier antigenico ha ampliato la distribuzione di cellule T CD4+ intraepiteliali residenti (TRM), con risultati superiori in termini di protezione rispetto alla formulazione con adiuvante alluminio convenzionale.
La modulazione della cinetica di rilascio attraverso il grado di cristallinità beta-sheet della fibroina offre al formulatore un parametro di controllo eccezionalmente fine, capace di orchestrare la presentazione antigenica in modo da modulare la polarizzazione macrofagica al sito di vaccinazione.
